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    TOPO Cloning Kit

    ——2017-11-09

    TOPO Cloning Kit

     

    GT1505-20T  GV TOPO-TA-Amp Cloning Kit適用于Taq DNA聚合酶擴增的末端加“A”的PCR片段的快速克隆

    GT1503-20T  GV TOPO-Blunt-Amp Cloning Kit適用于PfuKOD等高保真聚合酶擴增的平末端的PCR片段的快速克隆

    產品規格:20T

    保存與運輸:-20℃。

     

    一、產品特點

    1、連接只需5 min

    2、載體不含LacZ基因,無需藍白斑篩選。

    3、優質PCR產物(無非特異性條帶、無引物二聚體)可直接進行克隆,無需純化。

     

    二、PCR產物的制備:

    1、擴增引物不能磷酸化。

    2PCR反應結束后,電泳檢測PCR產物產量和質量,若有非特異性擴增或引物二聚體,則需切膠回收目的條帶后進行克隆。

     

    三、操作步驟

    克隆反應:

    1、室溫下,按下表配制反應體系:

    試劑

    添加量

    DNA片段

    0.5-8 μl

    TOPO cloning vector

    1 μl

    10×TOPO Buffer

    1 μl

    ddH2O

    x μl

       連接反應體系的總體積為10μl(用ddH2O補足)。輕彈離心管將反應體系混勻,短暫離心3-5s

       注:整個操作過程均在室溫條件下進行,切勿在冰上操作。

       如果PCR產物電泳檢測僅有很亮的目的條帶,無非特異性條帶和引物二聚體,可取0.5-1μlPCR產物原液直接進行克隆

    2、將離心管于室溫(22-30℃)下靜置0-5 min(不可超過5 min)。反應結束后將離心管放置在冰上,進行后續的轉化操作。

             注:室溫下(22-30℃)反應時間不可超過5 min,時間過長克隆效率會下降。若室溫較 低,建議使用PCR儀控溫,可設置25℃反應5min。若連接產物未能立即用于轉化,需保存于-20℃。不建議對連接產物做長期保存。

    3、陽性對照實驗:

    1μl試劑盒提供的對照片段進行克隆、轉化后,將菌液涂布在含有相應抗生素的培養平板上,37℃培養過夜。取菌斑進行PCR擴增。

    附:不同長度的DNA片段的最適添加量參照表:

    DNA片段大小(bp

    最適添加量(ng

    100-1000

    20-50

    1000-2000

    50-100

    2000-5000

    100-200

    轉化(此操作需在無菌條件下進行):

     

    1、取5 μl連接產物加入到50-100 μl 剛剛融化的感受態細胞中(感受態細胞應剛從-80℃取出,于冰上融化,剛剛融化便加入連接產物),溫和混勻,冰浴2-30 min

    242℃水浴熱激30s。(勿晃動離心管)

    3、立即轉移到冰上,靜置2 min(冰浴期間勿晃動離心管)。

    4、加入300-500 μl LB培養基(不含抗生素),37℃,200-250 rpm振蕩培養60 min

    注:當插入片段的長度<2 kb時,可省略復蘇步驟(步驟4),直接將轉化后的菌液涂布在含氨芐青霉素的平板上,37℃培養過夜。

    5、取200 ul菌液,涂布于含氨芐青霉素的平板上37℃培養過夜。

    注:若想獲得更多克隆,可將菌液低速(3000 g)離心2 min,棄掉部分上清液,用移液器吹打至菌體完全重懸,吸取全部菌液涂布于含氨芐青霉素的平板上,37℃培養過夜。

     

    檢測:

    1、菌落PCR法(無菌操作):

    1)挑選單菌落至10 μl無菌水中,充分混勻。

    2)取2 μl菌液作為PCR反應的模板,用試劑盒提供的M13F/M13R引物擴增插入片段。

    3PCR反應條件

         94  2 min

         94  30 sec

         56  30 sec    30 cycles

         72  1 kb/min  (根據片段大小確定延伸時間)

         72  10 min

    4)電泳檢測PCR產物,若載體自連,則擴增出的片段大小為143 bp

    5)確定重組子后將剩余的8 μl菌液轉接到LB培養基中(含相應的抗生素),搖菌培養過夜,然后提取質粒進行測序。

    2、限制性酶切法:

    1)挑取單克隆至LB培養基中(含相應抗生素),過夜搖菌,抽提質粒。

    2)用EcoRI/EcoRV/PstI或合適的限制性內切酶,對質粒進行酶切,鑒定重組子。

     

    測序:

        用M13FM13R通用引物測序,然后進行序列分析。

           M13F5-TGTAAAACGACGGCCAGT-3

           M13R5-CAGGAAACAGCTATGACC-3

     

    四、常見問題分析:

    重組子克隆菌少,或陽性率低:

    1、感受態效率低:使用轉化效率>5×107fcu/μg的感受態細胞;

    2、連接反應在低溫下(如碎冰上)操作:應在室溫下操作;

    3、連接反應時間過長:室溫下放置5min即可,時間過長效率會下降;

    4PCR產物加入量太少或太多:按照推薦量加入;

    5PCR產物純度低:重新擴增或重新純化PCR產物;

    6PCR產物質量低,切膠十紫外照射時間長:使用藍光切膠儀切膠或加快切膠速度,減少PCR產物在紫外下暴露的時間;

    7、轉化后沒有做復蘇:可加入LB培養基(無抗生素)震蕩培養60min

    8、克隆基因可能對宿主菌有毒性,比如某些編碼膜蛋白和DNA結合蛋白的基因,某些啟動子和調節序列基因,或含有倒置或串聯重復序列的基因:選用室溫過夜培養平板。

     

    附:載體圖譜


     


     

     

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